대답:
단백질을 웨스턴 블럿 막으로 적절히 옮길 수 있도록
설명:
일단 SDS-PAGE가 끝나면 겔을 캐스팅에서 제거한 후 그림과 같이 웨스턴 블 럿 셋업을합니다. 셋업이 끝나면 양성 측의 단백질 젤과 양성 측의 막을 사용합니다. 이 설정이 완료되면 전기장이 적용되어 단백질이 멤브레인으로 전달됩니다.
일정한 전계가 가해지기 때문에 거품이 겔과 멤브레인 사이에 들어가면 다음과 같은 이유로 단백질이 멤브레인으로 전달되지 않습니다
- 거품이있는 막과 겔 사이에 간격이 있습니다. 중공의 내부에서 전기장이 제로 (zero) 인 것처럼 전기장을 유지할 수 없게됩니다. 여기에는 공기 방울이 있습니다.
전기장은 단백질을 막으로 옮기는 데 필요하지만 공기 방울 때문에 전기장이 없어 단백질 전달이 없다.
여러분 모두가 답변을 업데이트 할 수 있습니다.
안녕!
웨스턴 블 롯팅이란 무엇입니까?
SDS-PAGE에 의해 분리 된 다음 멤브레인으로 옮겨진 단백질을 검출하는 것은 항체의 사용입니다. 세포는 단백질 (수천)의 혼합물을 함유하고 있으며 이들은 SDS-PAGE로 분리 될 수 있습니다. 그런 다음 SDS-PAGE의 단백질을 전기장을 사용하여 젤에서 멤브레인 (일반적으로 니트로 셀룰로오스 또는 폴리 비닐 리덴 플루오 라이드 (PVDF))으로 옮깁니다. 막은 목적 단백질에 특이적인 1 차 항체로 프로빙된다. 그런 다음 2 차 항체를 사용하여 1 차 항체를 검출합니다. 2 차 항체는 화학 반응에 의해 검출 될 수있는 마커를 포함하여 멤브레인에 가시적 인 밴드를 제공하거나 특수 카메라로 캡처 할 수있는 신호를 포함합니다. 필요하다면 필자는 커리어 동안 수백 개의 웨스턴 블롯을 수행 했으므로이 답변을 아주 깊이 확장 할 수 있습니다.
웨스턴 블롯에 밴드가 나타나지 않으면 어떤 문제가있을 수 있습니까?
많은 ... 서쪽 오점에 밴드가 나타나지 않는 데에는 여러 가지 이유가 있습니다. 과거에 샘플과 항체 조합을 사용 했습니까? 아래는 밴드가 나타나지 않도록 내가 생각할 수있는 몇 가지 예입니다. 젤에서 단백질이 옮겨 졌습니까? 밴드가 존재하는지 확인하기 위해 ponceau S 또는 amido black과 같은 것으로 막을 염색 해보십시오. 때로는 멤브레인을 젖게하고 빛에 비스듬하게 유지하여 단백질 밴드를 볼 수 있습니다. 1 차 항체가 작동합니까? 이것은 테스트하기가 힘든 것이며, 관심있는 단백질이 있다는 것을 알고있는 곳에 긍정적 인 컨트롤을 포함시킴으로써 가능한 유일한 방법입니다. 관심있는 단백질이 있다면 웨스턴 블로 팅 멤브레인 (예 : 젤을 사용하지 마십시오)에 부착하여 서양 블롯 인 것처럼 막을 처리하면 결과를 얻는 지 확인할 수 있습니다. 2 차 항체가 1 차 항체를 인식하고 있습니까? 다시 한 번 시험하기에 어려운 것입니다. 당신이 할 수있는 유일한 시험은 위에서 언급 한 현장 테스트입니다. 2. "검출 시스템"이 작동하고 있습니까? 사용하는 검출 방법에 따라 2 차 항체의 일부에서 스파이크를 시도하여 2 차 항체의 검출 제 및 효소를 유발하는지 확인할 수 있습니다. 즉, 2 차
왜 엘리사를 확인하는 데 웨스턴 블롯을 사용합니까? + 예제
일반적으로 항체 특이성 검사입니다. ELISA에서는 항체가 관심 단백질, 전혀 다른 단백질 또는 다양한 단백질에 결합하는지 여부를 알기가 매우 어렵습니다. 서양 얼룩은 항체의 특이성을 검사하는 데 사용됩니다 (서양 얼룩은 잘못된 단백질과의 모든 교차 반응을 감지하지 못할 수 있습니다). 웨스턴 블랏에서는 항체가 결합하는 단백질의 크기를 볼 수 있습니다 (ELISA에서는 불가능합니다). 따라서 예를 들어 항체가 56 kDa의 단백질에 결합해야하고 약 56 kDa의 밴드가 보이면 항체가 올바른 단백질에 결합한다는 사실을 합리적으로 확신 할 수 있습니다. 반면에 32kDa에서 밴드를 발견하면 항체가 잘못된 단백질에 결합한다는 결론을 내릴 수 있습니다. 마찬가지로, 많은 밴드가 서양 얼룩에 나타나면 항체가 다양한 단백질의 범위에 결합한다는 것이 단백질 분해가없는 경우에 나타납니다. 겔 및 다중 밴드에 나타나는 32 kDa 밴드의 예에서, 항체는 ELISA에 대한 특이성이 결여되고, ELISA에서 관찰 된 모든 결과가 관심있는 단백질에 특이 적이 아닐 수도 있음을 암시한다. 제가 이런 종류의 검사를 받았다면 항체를 시험하기 위해 일종의 "방해하는"시약을 포함시킬 수 있습니다. 예를 들어, 항체를 펩타이